L'un des secrets les plus fascinants révélé par les analyses aux rayons X concerne la main droite du docteur Tulp. À l'origine, Rembrandt avait peint la main sans les instruments de dissection, ajoutant les pinces plus tard pour renforcer l'aspect démonstratif de la scène. Plus troublant encore, le bras disséqué est anatomiquement "incorrect" ou du moins suspect : les tendons représentés ne correspondent pas exactement à la physiologie réelle d'un bras gauche, suggérant que Rembrandt a puisé ses connaissances dans un manuel d'anatomie (comme celui de Vésale) plutôt que d'avoir observé cette partie spécifique lors d'une dissection réelle.
Un autre mystère réside dans l'identité des commanditaires. Si les noms des sept chirurgiens sont inscrits sur la liste tenue par l'homme au fond à droite, deux d'entre eux ont été ajoutés ultérieurement à la composition initiale pour satisfaire de nouveaux donateurs. Les recherches scientifiques récentes ont également montré que le cadavre d'Aris Kindt a été légèrement "idéalisé" : bien qu'il ait été pendu pour vol, son cou ne présente aucune trace de la corde, et son corps est représenté avec une dignité inhabituelle pour un criminel exécuté, transformant son sacrifice involontaire en un monument pour la science.
Enfin, une analyse scientifique des pigments a révélé l'utilisation de smalt, un verre bleu broyé, pour les ombres des vêtements noirs, ce qui leur donnait initialement une profondeur beaucoup plus vibrante et bleutée qu'aujourd'hui. Le jaunissement des vernis au fil des siècles a assombri ces nuances, rendant le tableau plus monochrome qu'il ne l'était à l'origine. Le livre ouvert au premier plan, identifié comme le "De Humani Corporis Fabrica" de Vésale, sert de signature intellectuelle, plaçant Rembrandt non seulement comme peintre, mais comme penseur intégré à l'élite intellectuelle de son temps.