Eines der faszinierendsten Geheimnisse, das durch Röntgenanalysen enthüllt wurde, betrifft die rechte Hand von Dr. Tulp. Ursprünglich hatte Rembrandt die Hand ohne die Seziermesser gemalt und die Pinzette erst später hinzugefügt, um den demonstrativen Aspekt der Szene zu verstärken. Noch beunruhigender ist, dass der sezierten Arm anatomisch "inkorrekt" oder zumindest verdächtig ist: Die dargestellten Sehnen entsprechen nicht genau der tatsächlichen Physiologie eines linken Arms, was darauf hindeutet, dass Rembrandt sein Wissen eher aus einem Anatomie-Handbuch als aus der direkten Beobachtung bezog.
Ein weiteres Rätsel liegt in der Identität der Auftraggeber. Während die Namen der sieben Chirurgen auf der Liste stehen, die der Mann ganz rechts hält, wurden zwei von ihnen erst später zur ursprünglichen Komposition hinzugefügt. Neuere wissenschaftliche Untersuchungen haben auch gezeigt, dass der Leichnam von Aris Kindt leicht "idealisiert" wurde: Obwohl er wegen Diebstahls gehängt wurde, weist sein Hals keine Spuren des Seils auf, und sein Körper wird mit einer für einen hingerichteten Kriminellen ungewöhnlichen Würde dargestellt.
Schließlich ergab eine wissenschaftliche Analyse der Pigmente die Verwendung von Schmalte, einem gemahlenen blauen Glas, für die Schatten der schwarzen Kleidung, was ihnen ursprünglich eine viel lebendigere und bläulichere Tiefe verlieh als heute. Die Vergilbung der Firnisse im Laufe der Jahrhunderte hat diese Nuancen verdunkelt, wodurch das Bild monochromer wirkt, als es ursprünglich war. Das aufgeschlagene Buch im Vordergrund, identifiziert als Vesals "De Humani Corporis Fabrica", dient als intellektuelle Signatur Rembrandts.